Tin mới cập nhật

Thông tin kết quả nghiên cứu đề tài khoa học và công nghệ cấp Đại học mã số ĐH2016-TN04-01 do TS. Nguyễn Hữu Quân - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên chủ nhiệm

Đăng ngày: 08-08-2018; 280 lần đọc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung

Tên đề tài: Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng.

Mã số: ĐH2016-TN04-01

Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Hữu Quân

Tổ chức chủ trì: Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Thời gian thực hiện: Từ tháng 06/2016 đến tháng 6/2018

2. Mục tiêu

- Biểu hiện gene mã hóa chitinase từ nấm L. lecanii trong nấm men Pichia pastoris X33.

- Nghiên cứu đặc tính và vai trò của phức hệ chitinase/protease trong quá trình diệt nấm bệnh hại cây trồng nhằm định hướng tạo chế phẩm sinh học.

3. Tính mới và sáng tạo

- Đề tài là công trình đầu tiên đã chứng minh được vai trò của tín hiệu peptide liên quan tới: (1) năng suất biểu hiện của rmchit1 từ nấm L. lecanii 43H trong nấm men P. pastoris X33, (2) phương pháp tinh sạch rmchit1, (3) các yếu tố ảnh hưởng tới tính chất lý hóa của rmchit1.

- Đề tài bước đầu tinh sạch được protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 và xác định được nhiệt độ, pH tối ưu, độ bền nhiệt và độ bền pH của protease.

- Đề tài bước đầu chứng minh được phức hợp chitinase/protease có vai trò trong quá trình thủy phân nấm F. oxysporum R. solani.

4. Kết quả nghiên cứu

- Đã phân lập được gen mã hóa endochitinase không mang peptide tín hiệu (mchit1) từ nấm L. lecanii 43H và nhân dòng trong vector pJET1.2 blunt.

- Đã thiết kế được vector biểu hiện pPImchit1 mang gen mchit1 trong vector pPICZαA và biểu hiện được trong nấm men P. pastoris X33 với năng suất biểu hiện 2,048 U/ml.

- Đã tinh sạch được endochitinase tái tổ hợp không mang peptide tín hiệu (rmchit1) thông qua cột ProBondTM resin có kích thước 43 kDa, hoạt tính riêng đạt 159,45 U/mg protein, độ sạch 16,93 lần và hiệu suất thu hồi đạt 45%.

- Đã chứng minh được nhiệt độ và pH tối ưu cho rmchit1 hoạt động là 45°C, pH 6.0; rmchit1 bền ở dải nhiệt độ từ 30-35°C; và pH 6.0 sau16 giờ ủ. Các dung môi hữu cơ; chất tẩy rửa; ion kim loại và EDTA có ảnh hưởng đến hoạt tính của rmchit1.

- Đã tối ưu được điều kiện sinh tổng hợp protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 và tinh sạch được protease thông qua tủa muối ammonium sulfate và qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G100 có kích thước 40 kDa, hoạt tính riêng đạt 78,73 U/mg protein, độ sạch đạt 2,3 lần, hiệu suất thu hồi đạt 17%. Protease tinh sạch có nhiệt độ và pH tối ưu lần lượt là 40°C và pH 6,0.

- Bước đầu xác định được chitinase/protease có khả năng thủy phân sợi nấm F. oxysporum R. solani.

5. Sản phẩm

5.1. Sản phẩm khoa học

03 bài báo khoa học công bố trên tạp chí quốc tế và kỷ yếu hội nghị quốc tế

1. Huu Quan Nguyen, Van Hanh Vu, Phuong Dung Le, Hoang Mau Chu (2018), “High-level expression, purification and properties of an Endochitinase gene without signal peptide from Lecanicillium lecanii 43H in Pichia pastoris”, Molecular Biology Reports (SCIE, IF: 1,889).

2. Nguyen Huu Quan, Chu Hoang Mau, Tu Quang Tan (2018) “Purification and properties of protease from Lecanicillium lecanii”, Proceding: 5th Academic conference on natural science for young scientists, master and PhD. students from Asean countries, tr. 197-203.

3. Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh (2016) “Optimazation of culture conditions for production of protease by Lecanicillium lecanii”. Proceding: The 4th Academic conference on natural science for master and PhD students from Asean countries, tr. 248-254.

5.2. Sản phẩm đào tạo

Hướng dẫn 02 đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học đã nghiệm thu:

1. Đỗ Thị Kim Oanh, Thái Thị Hòa, Nguyễn Thị Vân (2017), Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp chitinase từ chủng nấm ký sinh côn trùng. Đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

2. Đinh Thị Thùy, Thân Thị Kim Phượng (2017), Nghiên cứu khả năng sinh enzyme ngoại bào từ các loài nấm sợi phân lập ở Thái Nguyên. Đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

6. Phương thức chuyển giao, địa chỉ ứng dụng, tác động và lợi ích mang lại của kết quả nghiên cứu

- Kết quả chuyển thành công cấu trúc mang gen mchit1 vào nấm men P. pastoris X33 là cơ sở cho việc sử dụng cấu trúc vector pPImchit1 chuyển vào nấm men P. pastoris X33, góp phần tạo rmchit1 có năng suất cao.

- Các kết quả thu được là cơ sở phát triển nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm nâng cao năng suất biểu hiện rmchit1, thuận lợi cho tinh sạch rmchit1 và nghiên cứu các tính chất lý hóa, cũng như ứng dụng trong thủy phân nấm hại cây trồng tại phòng thí nghiệm của Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

- Kết quả nghiên cứu và các bài báo công bố trên các tạp chí khoa học và kỷ yếu quốc tế được sử dụng làm tài liệu phục vụ đào tạo và nghiên cứu cho sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh và cán bộ của Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và một số trường đại học khác.


INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1. General information

- Project title: Research of gene expression and orientation of production of probiotics contained chitinase and protease from Lecanicillium lecanii to control against plant pathogenic fungi.

- Code number: DH2016-TN04-01

- Coordinator: Dr. Nguyen Huu Quan

- Implementing institution: Thai Nguyen University of Education.

- Duration: 24 months.

2. Objectives

- Expression of endochitinase gene from L. lecanii 43H in the P. pastoris X33

- Research the characterization and role of chitinase/protease associated with hydrolysis of plant pathogenic fungus to produce bio-preparations

3. Creativeness and innovativeness

- Project is the first work that has demonstrated the role of signal peptide in relation to: (1) expression of rmchit1 in P. pastoris X33, (2) rmchit1 purification, (3) Factors affecting the physical and chemical properties of rmchit1.

- The first step was to purify the protease from L. lecanii VTCC-F-1037 and initially showed the optimal pH and temperature for protease activity.

- The first step was to confirm that the chitinase/protease complex plays a role in the hydrolysis of F. oxysporum and R. solani.

4. Research results

- Isolated the gene encoding endochitnase without signal peptide (mchit1) from the L. lecanii 43H and cloned in pJET1.2 blunt vector.

- Designed pPImchit1 plasmid expression of mchit1 gene in yeast with expression yield of 2.048 U/ml.

- The rmchit1 was purified from the culture supernatant, by affinity chromatography with ProBondTM resin, and thus revealed only one protein band of approximately 43 kDa on SDS-PAGE (Fig. 5, lane 3) with a specific activity 159.45 U/mg protein, with a purification factor of 16.93 and a recovery of 45 %.

- It has been shown that the temperature and pH optimum for rmchit1 are 45°C, pH 6.0; rmchit1 was stable at a temperature range of 30-35°C; and pH 6.0 after 16 hours of incubation. Organic solvents; detergents; metal ion and EDTA affect the activity of rmchit1.

- The research determined the optimum conditions for protease biosynthesis from L. lecanii VTCC-F-1037 and an extracellular protease was purified by ammonium sulfate precipitation and throughout Sephadex G100 gel filtration chromatography; it showed a molecular mass of approximately 40 kDa with a specific activity of 78.73 U/mg protein, and the purification factor of 2.3 with a yield of 17%. Optimum temperature and pH were observed at 40°C and pH 6.0, respectively.

- Initially, the ability to hydrolyze mycelial fungus F. oxysporum and R. solani by the chitinase/protease complex.

5. Products

5.1. Journal papers

1. Quan Nguyen, Van Hanh Vu, Phuong Dung Le, Hoang Mau Chu (2018), “High-level expression, purification and properties of an Endochitinase gene without signal peptide from Lecanicillium lecanii 43H in Pichia pastoris”, Molecular Biology Reports (SCIE, IF: 1.889).

2. Nguyen Huu Quan, Chu Hoang Mau, Tu Quang Tan (2018) “Purification and properties of protease from Lecanicillium lecanii”, Proceding: 5th Academic conference on natural science for young scientists, master and PhD. students from Asean countries, tr. 197-203.

3. Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh (2016), “Optimazation of culture conditions for production of protease by Lecanicillium lecanii”. Proceding: The 4th Academic conference on natural science for master and PhD students from Asean countries, tr. 248-254.

5.2. Education

Bachelor training: Two Science research project of students1. Do Thi Kim Oanh, Thai Thi Hoa, Nguyen Thi Van (2017), Optimazation of culture conditions for production of chitinase from entomopathogenic fungi. Science research project of students. Thai Nguyen University of Education.

2. Dinh Thi Thuy, Than Thi Kim Phuong (2017), Study on the ability of extracellular enzyme from fungi isolated in Thai Nguyen. Science research project of students. Thai Nguyen University of Education.

6. Transfer alternatives, application institutions, impacts and benefits of research results

- The results of successful transferred of mchit1 structure into P. pastoris X33 is the basis for using the transgenic vector constructs to transferred into P. pastoris X33, contribute to high-level expression rmchit1.

- The results are the basis for the development of research on the application of transgenic techniques to high-level expression of rmchit1, which facilitates the purification of rmchit1 and to study the physicochemical properties as well as applications in fungal hydrolyzate plant diseases at laboratories of Thai Nguyen University of Education.

- Research results and articles published in the scientific and technological journals are also used as references in teaching and scientific research for students, undergraduate students, graduate students from Thai Nguyen University of Education and some other universities.

File đính kèm:

Báo cáo tóm tắt

Báo cáo tổng kết

Tin bài: Ban KHCN&MT