Tin mới cập nhật

Thông tin KQNC đề tài KH&CN cấp Bộ mã số B2015-TN03-04 do PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên chủ nhiệm

Đăng ngày: 11-05-2018; 131 lần đọc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung

- Tên đề tài: Nghiên cứu nâng cao hàm lượng alkaloid trong cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) bằng công nghệ gen.

- Mã số: B2015-TN03-04

- Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm

- Cơ quan chủ trì: Đại học Thái Nguyên

- Thời gian thực hiện: 24 tháng

2. Mục tiêu

Mục tiêu tổng quát

Tạo được dòng cây dừa cạn chuyển gen có hàm lượng alkaloid (vinblastine, vincristine) cao hơn dạng tự nhiên.

Mục tiêu cụ thể

(1) Phân lập được gen mã hóa enzyme peroxidase (Prx) và deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase (DAT) liên quan đến đến tổng hợp alkaloid (vinblastine, vincristine) từ cây dừa cạn ở Việt Nam.

(2) Thiết kế được các vector biểu hiện mang gen mã hóa enzyme peroxidase (Prx) và deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase (DAT) đặc trưng trong cây dừa cạn. 

(3) Chuyển được các cấu trúc đã được thiết kế vào cây dừa cạn.

(4) Phân tích các dòng cây dừa cạn chuyển gen thu được trên môi trường chọn lọc ở mức độ sinh hoá và phân tử.

3. Tính mới và sáng tạo

(1) Đã phân lập được gen CrPrx, CrDAT từ mRNA các giống dừa cạn hoa hồng tím và hoa trắng. Gen CrPrx (cDNA) có kích thước 993bp. Gen CrDAT (cDNA) có kích thước 1320 bp.

(2) Gen CrPrx, CrDAT phân lập từ giống dừa cạn hoa hồng tím được sử dụng để thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx/CrDAT và biến nạp thành công vào mô dừa cạn in vitro.

(3) Là công trình đầu tiên nghiên cứu hoàn thiện quy trình tái sinh in vitro cây dừa cạn phục vụ chuyển gen từ nách lá mầm trên môi trường MS cơ bản, bổ sung BAP 0,5mg/l.

(4) Các dòng dừa cạn chuyển gen đã được xác định sự có mặt của gen chuyển bằng phương pháp PCR, sự biểu hiện gen thông qua phương pháp RT PCR và lai Southern.

4. Kết quả nghiên cứu

(1) Đã tiến hành phân lập, tách dòng phân tử và xác định trình tự nucleotide gen CrPrxCrDAT từ cây dừa cạn hoa hồng tím và hoa trắng. Gen CrPrx (cDNA) có kích thước 993 bp, mã hóa cho 330 amino acid, gen CrDAT (cDNA) có kích thước 1320 bp, mã hóa cho 439 amino acid.

(2) Vector chuyển gen thực vật pBI121-CrPrx pBI121-CrDAT được thiết kế thành công. Gen chuyển CrDAT đã hợp nhất vào hệ gen của cây thuốc lá chuyển gen và được biểu hiện. Protein tái tổ hợp CrDAT có kích thước khoảng 51 kDa được biểu hiện trên cây thuốc lá chuyển gen.

(3) Môi trường MS bổ sung sucrose 30g/l; agar 10g/l; BAP 1,0mg/l và IBA 0,6mg/l; nước dừa 100ml/l; pH = 5,8 thích hợp cho sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên. Môi trường MS bổ sung sucrose 30g/l; agar 10g/l; BAP 0,5mg/l và IBA 0,4mg/l; nước dừa 100ml/l; pH = 5,8, thích hợp cho sự phát sinh chồi và sinh trưởng chồi từ nách lá mầm.

(4) Hiệu quả chuyển gen ở cây dừa cạn qua nách lá mầm được tối ưu ở nồng độ A.tumefaciens là OD600nm= 0,8; acetosyringone là 100µM và thời gian nhiễm khuẩn là 30 phút; chọn lọc bằng kháng sinh kanamycine thích hợp ở nồng độ 50 mg/l.

(5) Cấu trúc pBI121-CrDAT đã được chuyển thành công vào cây dừa cạn hoa hồng tím và tạo được các dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1 với hiệu suất chuyển gen là 1,02%. Protein tái tổ hợp CrDAT được biểu hiện ở 4 dòng dừa cạn chuyển gen với khối lượng phân tử khoảng 51kDa. Hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT khác nhau giữa bốn dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1 và dao động từ 2,86 µg/mg đến 5,12 µg/mg. Hàm lượng alkaloid tổng số của 4 dòng chuyển gen tăng từ 0,21 - 15,57 (lần) so với cây đối chứng không chuyển gen. Hàm lượng Vincristine ở các dòng chuyển gen tăng từ 7,02 µg/g đến 10,53 µg/g mẫu sấy khô ở 550C trong 4 giờ, cao hơn so với đối chứng không chuyển gen từ 1,62 lần đến 2,48 lần.

(6) Chuyển thành công cấu trúc pBI121-CrPrx và tạo được 4 dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T0 đã được phân tích có mặt của gen chuyển và biểu hiện gen chuyển ở mức độ phiên mã.

5. Sản phẩm

5.1. Sản phẩm khoa học

- Các bài báo công bố

1.   Bùi Thị Hà, Lương Thanh Huyền, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2014), “Tách dòng phân tử gen mã hóa peroxidase từ hai giống dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) tại Thái Nguyên”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, 129(15), tr. 103-108.

2.   Bùi Thị Hà, Trần Thị Anh, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2015), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh đa chồi in vitro ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)”, Tạp chí Khoa học - ĐH Quốc gia Hà Nội, 31(4S), tr. 56-62.

3.   Bùi Thị Hà, Hồ Mạnh Tường, Hoàng Phú Hiệp, Lê Văn Sơn, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2015), “Tách dòng phân tử và thiết kế vector chuyển gen DAT phân lập từ cây dừa (Catharanthus roseus (L.) G. Don)”, Tạp chí Sinh học, 37(2), tr. 236-242.

4.   Nguyễn Thị Tâm, Trần Thị Thanh Hương, Bùi Thị Hà, Hoàng Phú Hiệp, Vũ Thị Thu Thủy, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2015), “Đặc điểm của gen CrORCA3 liên quan đến sự tổng hợp Alkaloid phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don”, Tạp chí Khoa học -ĐH Quốc gia Hà Nội, 31(4S), tr. 321-326.

5.   Bùi Thị Hà, Đào Thị Nhâm, Hoàng Ngọc Anh, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2017), “Thiết kế cấu trúc nhằm tăng cường biểu hiện gen mã hóa peroxidase ở cây dừa cạn (Cantharanthus roseus (L.) G. Don)” chuyển gen, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 15(3), tr. 1-7.

6.   Bùi Thị Hà, Đỗ Huy Hoàng, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2016), “Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Cantharanthus roseus (L.) G. Don)”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, 157(12/1), tr. 71-768.

7.   Bùi Th , Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Thị Tâm, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2018), “Expression analysis of the recombinant Catharanthus roseus deacetylvindoline 4-O-acetyl transferase in tobacco plants”. Đã được chấp nhận đăng trên tạp chí Southern Cross Journals (Australia).

- Các trình tự gen đã đăng ký trên ngân hàng gen quốc tế

1.   Bui H. T., Hoang H. P., Nguyen T. T., Chu M. H. (2015), Catharanthus roseus mRNA for deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase (DAT) isolate TN1 (Pink-purple flowwer), Genbank: LN809930.1.

2.   Bui H. T., Hoang H. P., Nguyen T. T., Chu M. H. (2015), Catharanthus roseus mRNA for deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase (DAT) isolate TN1 (White flowwer), Genbank: LN809930.2.

3.   Bui H. T., Luong H. T., Nguyen T. T., Chu M. H. (2015), Catharanthus roseus mRNA for peroxidase (prx gene), isolate TN1  (Pink-purple flower), Genbank: LN809932.1.

4.   Bui H. T., Luong H. T., Nguyen T. T., Chu M. H. (2015), Catharanthus roseus mRNA for peroxidase (prx gene), isolate TN2 (White flower), Genbank: LN809933.1.

5.2. Sản phẩm đào tạo

- Đào tạo thạc sĩ

1.   Trần Thị Anh (2015), Nghiên cứu môi trường tái sinh cây dừa cạn (Cantharanthus roseus (L.) G. Don phục vụ chuyển gen, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên.

2.   Lương Thanh Huyền (2015), Nghiên cứu đặc điểm gen mã hóa peroxidase ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên.

3.   Đào Thị Nhâm (2016), Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don). Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên.

4.   Đỗ Huy Hoàng (2016), Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don). Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên.

5.   Hoàng Ngọc Anh (2017), Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.). Luận văn thạc sĩ Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.

- Đào tạo tiến sĩ

1.   Bùi Thị Hà (2017), Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp alkaloid từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don ), Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên.

5.3. Sản phẩm ứng dụng

- Thiết kế thành công 2 cấu trúc vector chuyển gen pBI121- CrDAT và pBI121-CrPrx.

- Tạo được 02 chủng A. tumefaciens tái tổ hợp chứa cấu trúc pBI121- CrDAT và pBI121-CrPrx.

- Tạo được 04 dòng dừa cạn mang gen chuyển CrDAT thế hệ T1 và 04 dòng dừa cạn mang gen chuyển CrPrx thế hệ T0.

6. Phương thức chuyển giao, địa chỉ ứng dụng, tác động và lợi ích đem lại của kết quả nghiên cứu

- Việc chuyển thành công cấu trúc mang gen CrDATCrPrx liên quan đến tổng hợp alkaloid hữu ích vào giống dừa cạn hoa hồng tím là cơ sở để chuyển các cấu trúc mang các gen trên vào các giống dừa cạn khác góp phần tạo các giống dừa cạn có khả năng nâng cao tổng hợp các TIA hữu ích.

- Các kết quả công bố trên các tạp chí, hội nghị khoa học được sử dụng làm tài liệu phục vụ đào tạo và nghiên cứu khoa học cho sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh của Trường Đại học Sư phạm, Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên và các trường đại học khác.

 

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1.General information

-   Project title: Research on enhancer contents of alkaloid in Periwinkle (Catharanthus roseus (L.) G. Don) by transgenic technology.

-   Code number: B2015-TN03-04

-   Coordinator: Prof. Dr. Nguyen Thi Tam

-   Implementing institution: Thai Nguyen

-   Duration: 24 months

2. Objectives

2.1. General objective

Tạo được dòng cây dừa cạn chuyển gen có hàm lượng alkaloid (vinblastine, vincristine) cao hơn dạng tự nhiên.

Creating transgenic Periwinkle with higher contents of aklaloid (vinblastine, vincristine) than that of natural form.

2.2. Specific objectives

1.   Isolating gene encoding enzyme peroxidase (Prx) and deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase (DAT) related to synthesis alkaloid (vinblastine, vincristine) of  Catharanthus roseus (L.) G. Don.

2.   Creating transgenic vectors carrying genes encoding enzyme peroxidase (Prx) and deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase (DAT) isolated from Catharanthus roseus (L.) G. Don.

3.   Successfully transplanting structures designed into shallow Periwinkle

4.   Analysing transgenic Periwinkle obtained on selected environment at biochemical and molecular level.

3. Creativeties and innovativeness

1.   Isolated CrPrx and CrDAT genes from mRNA of Periwinkles, purple and white. The CrPrx (cDNA) is 993bp, and the CrDAT (cDNA) is 1320bp.

2.   CrPrx, CrDAT genes isolated from Periwinkles and purple roses are used to createtransgenic vectors carrying structural gene CrPrx/CrDAT and transform in Periwinkle tissue in vitro.

3.   Being the first study completing process of regeneration in vitroof Periwinkle for transforming gene from axillary sprouts of Periwinkle in the basic MS environment and supplementing BAP 0,5mg/l.

4.   The transgenic Periwinkle lines are determined to contain genes transformed by PCR method, gene expression via RT-PCR method and Southern hybridization.

4. Research results

1.   Genes were isolated, molecule line was seperated and sequence of CrPrx (cDNA) and CrDAT nucleotide was determinedfrom Periwinkle, purple and white. CrPrx (cDNA) which is 993bp in size is encoded for 330 amino acid, and CrDAT (cDNA) which is 1320bp in size is encoded for 439 amino acid.

2.   Transgenic vectors for plants pBI121-CrPrx and pBI121-CrDAT were successfully created. Gene transforming CrDAT was merged into gene system of transgenic tobacco and were expressed. Protein recombining CrDAT, approximately 51 kDA in size, and was expressed in transgenic tobacco.

3.  MS environment supplements with 30g/l sucroce; 10g/l agar; 1,0mg/l  BAP and 0,6mg/l  IBA; 100ml coconut juice; and 5,8 pH that is suitable with the the growth of axilarry sprouts. 

4.   The transgenic efficieny of Periwinkle via axilarry sprouts was maximized at A.tumefaciensconcentration of OD600nm= 0,8; acetosyringone of 100µM, and the inflection time of 30 minutes. It was selected by appropriate kanamycine antibiotics at a concentration of 50mg/l

5.   The pBI121-CrDAT structure was successfully transformed in Periwinkle and purple, and created transgenic Preiwinkles at T1 generation with transgenic productivity of 1,02%. Protein recombining CrDAT was expressed at 4 transgenic Periwinkle lines with molecular weight of 51kDA. Contents of Protein recombining CrDAT were different among 4 these lines at T1 and fluctuated from 2,86 µg/mg to 5,12 µg/mg. The total alkaloid content of the four transgenic lines increased from 0.21 to 15.57 (times) compared with non-transgenic control. The vincristine content of the transgenes increased from 7.02 μg / g to 10.53 μg / g dried samples at 550C for 4 hours, higher than the non-transgenic control at 1.62 to 2.48 times.

6.   Successfully transforming pBI121-CrPrx structure and creating 4 trasgenic Periwinkle lines at T0 analized the presence and expression of transgenic genes at transcription level.

5.   Product

5.1.  Scientific products

- Journal papers

1. Bui Thi Ha, Luong Thanh Huyen, Nguyen Thi Tam, Chu Hoang Mau (2014), “Molecular cloning of the gene encoding peroxidase isolated from two Catharanthus roseus cultivars at Thai Nguyen”, Journal of Science and Technology – Thai Nguyen University, 129(15), pp. 103-108.

2.   Bui Thi Ha, Tran Thi Anh, Nguyen Thi Tam, Chu Hoang Mau (2015), “Study on the regeneration system of multi-buds in vitro for Periwinkle (Catharanthus roseus (L.) G. Don), Journal of ScienceVietnam National University, 31(4S), pp. 56-62.

3.   Bui Thi Ha, Ho Manh Tuong, Hoang Phu Hiep, Le Van Son, Nguyen Thi Tam, Chu Hoang Mau (2015), “Molecular cloning and designing transgenic vector carrying DAT gene isolated from Catharanthus roseus (L.) G. Don”, Journal of Biology, 37(2), pp. 236-242.

4.   Nguyen Thi Tam, Tran Thi Thanh Huong, Bui Thi Ha, Hoang Phu Hiep, Vu Thi Thu Thuy, Chu Hoang Mau (2015), “The Charateristics of CrORCA3 gene related to the synthesis of alkaloid isolated from Periwinkle Catharanthus roseus (L.) G. Don”, Journal of ScienceVietnam National University, 31(4S), pp. 327 - 332.

5.   Bui Thi Ha, Dao Thi Nham, Hoang Ngoc Anh, Ho Manh Tuong, Le Van Son, Nguyen Thi Tam, Chu Hoang Mau (2017), “Designing structure to overexpress gene encoding peroxidase in transgenic Periwinkle Catharanthus roseus (L.) G. Don”, Journal of Biotechnology, 15(3), pp. 1-7.

6.   Bui Thi Ha, Do Huy Hoang, Nguyen Thi Tam, Chu Hoang Mau (2016), “The transgenic GUS process performed in Periwinkle, Journal of Science and Technology – Thai Nguyen University, 157(12/1), pp. 71-75.

7.   Bui Thi Ha, Nguyen Thi Ngoc Lan, Nguyen Thi Tam, Le Van Son, Chu Hoang Mau (2018) “(2018), “Expression analysis of the recombinant Catharanthus roseus deacetylvindoline 4-O-acetyl transferase in tobacco plants”, Accepted.

- The genes sequences published on Genbank

5.   Bui H. T., Hoang H. P., Nguyen T. T., Chu M. H. (2015), Catharanthus roseus mRNA for deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase (DAT) isolate TN1 (Pink-purple flowwer), Genbank: LN809930.1.

6.   Bui H. T., Hoang H. P., Nguyen T. T., Chu M. H. (2015), Catharanthus roseus mRNA for deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase (DAT) isolate TN1 (White flowwer), Genbank: LN809930.2.

7.   Bui H. T., Luong H. T., Nguyen T. T., Chu M. H. (2015), Catharanthus roseus mRNA for peroxidase (prx gene), isolate TN1  (Pink-purple flower), Genbank: LN809932.1.

8.   Bui H. T., Luong H. T., Nguyen T. T., Chu M. H. (2015), Catharanthus roseus mRNA for peroxidase (prx gene), isolate TN2 (White flower), Genbank: LN809933.1.

5.2. Education

- Master education

1.   Tran Thi Anh (2015), Study on the  regeneration cutivation for Periwinkle (Catharanthus roseus (L.) G. Don) in service of  transgenic. The Biological master thesis, University of education – Thai Nguyen University.

2.   Luong Thanh Huyen (2015), Study on the characteristics of gene encoding peroxidase isolated fromCatharanthus roseus. The Biological master thesis, University of education – Thai Nguyen University.

3.   Dao Thi Nham (2016), Creating transgenic vector carrying gene CrPrx isolated from Periwinkle(Catharanthus roseus (L.) G. Don). The Biological master thesis, University of education – Thai Nguyen University.

4.   Do Huy Hoang (2016), The transgenic GUS process performed in Periwinkle(Catharanthus roseus (L.) G. Don). The Biological master thesis, University of education – Thai Nguyen University.

5.   Hoang Ngoc Anh (2017), Study on transgenic gene encoding enzyme peroxidase related to synthesis alkaloid of  Catharanthus roseus (L.) G. Don. The Biotechnological master thesis, University of Scienses – Thai Nguyen University.

- Doctor education

Bui Thi Ha (2017), Research on cloning and expression gene encoding enzyme relatedrelated to synthesis alkaloid in Periwinkle(Catharanthus roseus (L.) G. Don), The Biological docter thesis, University of education – Thai Nguyen University.

5.3. Products application

-   Successfully creating 2 transgenic vector structures pBI121-CrDAT and pBI121-CrPrx.

-   Creating 2 A.tumefaciens recombining that contains pBI121- CrDAT and pBI121-CrPrx structure.

-   Creating 4 Periwinkle lines with transgenic gene CrDAT at T1 and 4 others with transgenic gene CrDAT at T0.

6. Transfer alternatives, application institution, impacts and benefits of research results

- The successful transformation of structure containing genes CrDAT and CrPrx is related to gathering the usefulness of alkaloid into Periwinle and purple roses. It is the basis of structural transformation carrying the below genes in other Periwinkle in order to partly create Periwinkle with ability to gather all useful TIA.

- The results published in magazines and scientific conferences are used as materials for training and scientific researches for students, masters students and PhD students from University of Education, University of Science-Thai Nguyen University and others.

Tin bài: Ban KHCNMT